1. 引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。
引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性;
2. 引物的长度一般为15-30 bp。常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应;
3. 引物不应形成二级结构。引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行;
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%。过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大;
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T);
6. 引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
7. 引物3’端不可修饰。引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。8. 引物序列自身或者引物之间不能在出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加;9. G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3'端G值较低(绝对值不超过9)，而5’端和中间G值相对较高的引物。引物的3’端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应;
