RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是一种用于快速扩增cDNA的5'端和3'端的技术。
该技术可以在已知部分cDNA序列的情况下,获得完整的cDNA序列。RACE技术包括3'RACE和5'RACE两部分。以下分别介绍3'RACE和5'RACE的原理及实验步骤:3'RACE:原理:利用反转录酶将mRNA反转录成cDNA,然后通过PCR扩增cDNA的3'端。实验步骤:
1. 准备总RNA或poly(A)RNA作为实验样本。
2. 设计反转录引物,通常使用oligo(dT)作为引物。
3. 将mRNA反转录成cDNA,得到第一条cDNA链。
4. 根据已知的cDNA序列设计基因特异性引物(GSP),合成第二条cDNA链。
5. 以基因特异性引物(GSP)和正义链3'端引物为引物,对得到的cDNA链进行PCR扩增,获得cDNA的3'端序列。
5'RACE:原理:利用已知cDNA序列设计基因特异性引物,逆转录获得第一条cDNA链,然后通过PCR扩增cDNA的5'端。实验步骤:
1. 准备总RNA或poly(A)RNA作为实验样本。
2. 设计基因特异性引物(GSP),并根据已知的cDNA序列合成引物。
3. 将mRNA逆转录成cDNA,得到第一条cDNA链。
4. 使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在cDNA 3'端加Poly(C)尾。
5. 根据Poly(C)尾设计特定引物,合成第二条cDNA链。
6. 以第二条cDNA链为模板,利用基因特异性引物(GSP)合成双链cDNA。
7. 以基因特异性引物(GSP)和正义链5'端引物为引物,对得到的cDNA链进行PCR扩增,获得cDNA的5'端序列。通过以上实验步骤,可以获得完整的cDNA序列。RACE技术在基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。