制作qPCR扩增效率标准曲线的步骤如下:
1. 准备基因片段:选择一个目标基因的合适片段进行扩增,片段应在100到300碱基对之间。
若已有目标基因的克隆,可通过PCR扩增得到片段;否则,可选用合成基因片段。
2. 扩增基因片段:进行PCR扩增反应,使用适当浓度的DNA模板和合适的引物。确保PCR反应条件和参数设置适当,并进行充分扩增以获得足够的DNA产物。
3. 确定DNA浓度:使用紫外线分光光度计或荧光比色法测定PCR产物的DNA浓度。确保浓度准确,以便后续稀释。
4. 选取初始模板浓度:根据实验需求,选择一个合适的起始模板浓度,通常在1×10^2到1×10^6个分子之间。
5. 串联稀释模板:将初始模板稀释串联,如1:5、1:10、1:20、1:40等,以获得一系列含有不同模板浓度的样品。
6. 进行qPCR扩增:使用qPCR仪器和合适的引物对每个稀释样品进行qPCR扩增,记录Ct值(荧光强度达到阈值的循环数)。
7. 绘制标准曲线:将每个稀释样品的模板浓度(对数刻度)与其相应的Ct值(线性刻度)作图,得到一条线性标准曲线。8. 计算扩增效率:通过对标准曲线进行线性回归分析,计算扩增效率。常用的计算公式为E = 10^(-1/slope) - 1,其中slope为标准曲线的斜率。9. 验证标准曲线:将新的样品进行qPCR扩增,并根据标准曲线计算模板浓度。比较计算出的浓度和实际浓度,验证标准曲线的准确性和可靠性。请注意,在制作qPCR扩增效率标准曲线时,要保证实验条件的稳定性和准确性,如使用相同批次的引物、酶和试剂,严格控制反应条件的温度和时间等。