梯度洗脱是指在同一个分析周期中随着时间的变化按一定程序梯度性地改变洗脱液的比例(浓度配比、成分、离子强度、溶液极性等)或pH，以期将层析柱上不同的组分洗脱出来的方法。
从而可以使一个复杂样品中性质（极性）差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。梯度洗脱一般分为二元高压梯度，二元低压梯度和四元低压梯度；二元高压梯度需要两台高压泵，二元低压梯度和四元低压梯度都是只需要一台高压泵和一个比列阀。梯度洗脱的原理具体地讲，当样品随梯度起点的流动相进入色谱柱入口时，由于起点流动相中弱洗脱溶剂A含量较高，强洗脱溶剂B含量较低，化合物C1(保留性适中)和化合物C2(保留较强)因分配系数(k值)较高而滞留于色谱柱入口附近，几乎未移动。一段时间后，B增加到一定数值，C1的k值达到足够小(比如小于10)，其在柱中的移动速率明显增大，并且随着B的增加，其移动速率愈加快速，直到tC1时流出色谱柱，被检测器检测到并被记录成色谱峰C1，tC1虽然比等度时的保留时间长很多，但C1的的平均k值却很小，因而色谱峰并未展宽，灵敏度仍处于较高水平。B持续增加，在随后的某个时间点，C2的k值也降到10以下，C2的移动速率也开始变快，以与C1类似的方式于tC2被洗脱出色谱柱，其平均k值同样很小，色谱峰亦未展宽，灵敏度处于较高水平。流动相的梯度变化即流动相极性、PH值等的梯度变化，即洗脱能力成梯度变化。洗脱要求1.洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使各峰完全或基本分离；2.梯度的上限（强洗脱溶剂的比例）要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。
3.梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。
