酶和酶作用底物(一)酶的要求: 一个酶蛋白分子每分钟可催化10 3 ~10 4 个底物分子转变成有色产物。
用于标记的酶应符合:
1. 酶的活性要强,催化反应的转化率高,纯度高。
2.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量,方法简单易行、敏感和重复性好。
3.作用专一性强 ,酶活性不受样品中其他成分的影响,受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后,酶活性可出现抑制或激活。
4.易与抗体或抗原偶联 ,标记后酶活性保持稳定,且不影响 标记抗原与抗体的免疫反应性 。
5.酶、辅助因子及其底物对人体无害 ,酶的底物易于配制、保存,酶及其底物应价廉易得。(二)常用的酶1.辣根过氧化物酶(HRP):目前酶联免疫吸附试验中应用最广泛 的标记用酶。由无色的糖蛋白(主酶)和亚铁血红蛋白(辅基)结合而成的复合物。辅基是酶活性基团 ,而主酶则与酶活性无关 ,HRP的纯度用RZ(HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值)表示,RZ值应大于3.0 。RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量 ,并非表示HRP制剂的真正纯度,而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高,RZ值与酶活性无关 。酶活性以单位U表示: 即1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。酶变性后,RZ值不变但活性降低 ,因此使用酶制剂时,酶活性单位比RZ值更为重要。